우리 몸속 세포들은 일정 시간이 지나면 스스로 죽음(세포사멸)을 맞이한다. 이는 몸의 균형을 유지하는 자연스러운 과정으로, 오래되거나 손상된 세포가 제거되지 않으면 암, 심장질환, 치매와 같은 질환이 발생할 수 있다. 따라서 세포가 언제, 어떻게 죽는지를 정확히 관찰하는 것은 질병의 조기 진단과 치료 효과 평가 등 생명과학 및 의약학 분야에 매우 중요한 도구가 되고 있다.

한국생명공학연구원(원장 권석윤, 이하 생명연) 미래형동물자원센터 김선욱 박사 연구팀은 세포 내에서 일어나는 ‘세포사멸(apoptosis)’ 과정을 실시간으로 시각화할 수 있는 ‘형광 리포터’ 기술 개발에 성공했다고 29일 밝혔다.

▲한국생명공학연구원 미래형동물자원센터 김선욱 박사

이번 기술은 형광단백질 돌연변이체를 활용해 세포사멸을 직접 관찰할 수 있어, 기존 세포사멸 감지 기술의 한계를 극복하고 상용화 가능성을 크게 높여 신약 개발 및 생명과학 연구의 패러다임을 바꿀 것으로 기대된다.
 

그동안 세포사멸을 감지하기 위해 현미경 관찰, 유전자 분석, 형광단백질 기술 등이 쓰여 왔다. 기존 분석법은 복잡한 샘플 처리, 별도 염색과정, 정확도 등의 측면에서 문제점이 있었다.
 

 연구팀은 세포사멸 과정에서 ‘최종 집행자’ 역할을 하는 효소인 카스파제-3(caspase-3)에 주목했다. 이 효소는 특정 아미노산 서열(DEVDG)을 선택적으로 절단하는 특성이 있어 이를 GFP(녹색형광단백질) 내부에 정밀하게 삽입함으로 세포사멸이 일어날 때 형광이 소실되는 현상을 실시간으로 감지·측정할 수 있는 차세대 바이오 센서를 개발하였다.

 현재까지 개발된 GFP 형광리포터 중에서 가장 심플한 작동방식과 초소형 디자인을 구현함으로써 센서의 민감도와 정확성을 크게 향상시켰다. 또한, 독성물질 처리, 항암제 등 다양한 조건에서 세포사멸 과정을 현미경으로 실시간 추적할 수 있음을 검증했다.
 

 이번에 개발한 기술은 암세포주 뿐만 아니라 다양한 동물세포 모델에도 적용 가능하여 신약 후보 물질의 세포 독성 평가와 약물 효능 검증에 폭넓게 활용될 수 있으며, 더 나아가 알츠하이머병, 심장질환, 암 등 세포사멸과 관련된 질환 연구에 기여할 것으로 기대된다.
 

 연구책임자인 김선욱 박사는 “우리가 개발한 센서는 기존 방법보다 훨씬 민감하고 간편하게 세포사멸을 관찰할 수 있어 향후 항암제와 같은 신약 후보 물질의 효능을 빠르게 검증하거나, 세포사멸이 중요한 역할을 하는 퇴행성 뇌질환 연구에도 폭넓게 활용될 것으로 기대된다”고 밝혔다.
 

 이번 연구는 저명한 국제학술지인 Journal of Advanced Research (IF 13.0) 6월 24일자 온라인 판에 게재되었으며, (논문명 : Designing an apoptosis reporter by mutagenesis-based insertion of caspase-3 cleavage motif into green fluorescence protein / 교신저자 : 송인성 교수‧박영호 박사‧김선욱 박사 / 공동 1저자 : 이동길 박사‧양해준 박사‧채운빈 박사)

 이번 연구는 국가과학기술연구회 주관 BIG(Big Issue Group) 사업(생명연 주요사업), 글로벌 TOP 사업, 과기정통부 개인기초연구사업 우수신진연구, 산업통상자원부 바이오산업핵심기술개발 사업의 지원으로 수행되었다.

그림 1. EGFP #4 세포주 세포사멸 리포터로서 유효성 검증

(A) 세포사멸 유발 농도에 따른 형광 사진 결과

(B) 세포사멸 유발 농도에 따른 단백질 발현 분석 결과

(C) 세포사멸 유발 후 TUNEL 분석 형광 사진 결과

(D) TUNEL 염색된 세포 비율 그래프

(E) 세포사멸 유발 후 cleaved caspase-3 면역염색 형광 사진 결과

(F) Cleaved caspase-3 염색된 세포 비율 그래프

(G) Cleaved caspase-3와 GFP간의 공존화율 분석 결과

그림 2. 세포사멸 리포터 실시간 모니터링

(A) 세포사멸 유발 후 30분 간격으로 형광 모니터링 결과

(B) 세포사멸 유발 후 시간에 따른 단백질 발현 분석 결과

(C) 세포사멸 유발, Caspase-3 억제, Caspase-1 억제한 그룹에서 실시간 형광 모니터링 결과

(D) H2O2 농도별 처리하여 세포사멸 모니터링 결과